Katı substrat fermentasyonu (KSF) ile trichoderma harzianum ve trichoderma viride türü funguslarda ksilanaz üretimi, saflaştırılması ve biyokimyasal özelliklerin belirlenmesi / Hüseyin Alper İrtem; tez danışmanı Prof.Dr.Ayşe Dilek Azaz

Tez (Dok)--Balıkesir Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı.

Kaynakça var.

Bu çalışmada, Katı Substrat Fermentasyon (KSF) kültür ortamında geliştirilen Trichoderma harzianum NRRL 13019 ve Trichoderma viride NRRL 6418’den β-ksilosidaz enzimi saflaştırılmış ve biyokimyasal karakterizasyonu yapılmıştır. Birçok biyoteknolojik uygulamalarda ticari öneme sahip, β-ksilosidaz enzimi, KSF ortamında substrat olarak buğday kepeğinin kullanılmasıyla geliştirilen Trichoderma harzianum (KSF ortamının nemlendirme sıvısı pH 4,0 Sitrik asit monohidrat (C6H8O7H2O), optimum sıcaklık 35oC ve inkübasyon süresi 7 gün) ve Trichoderma viride (KSF ortamının nemlendirme sıvısı pH 8,5 Di-sodyum hidrojen fosfat dihidrat (Na2HPO4.2H2O) tamponu ile nemlendirilerek, optimum sıcaklık 25oC ve inkübasyon süresi 7 gün) suşlarından elde edilmiştir. β-ksilosidaz enzimi, amonyum sülfat çöktürmesi ve Sepharose-4B-L-Tyrosine-1-Napthylamine kullanılarak Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi ile iki basamakta saflaştırılmıştır. Saflaştırılan β-ksilosidaz enzim aktivitesi, p-nitrofenil-β-D-ksilopiranosit (pNPX) substratı kullanılarak belirlenmiştir. Trichoderma harzianum β-ksilosidaz enzimi (Thβ) %50,48 verimle 215,76 kat; Trichoderma viride β-ksilosidaz (Tvβ) ise %33,43 verimle 92,39 kat saflaştırılmıştır. SDS-PAGE ve Native-PAGE ile Thβ ve Tvβ enzimlerinin molekül ağırlıkları sırasıyla 20 kDa ve 25 kDa olarak belirlenmiş olup tek alt üniteden oluştukları tespit edilmiştir. Thβ ve Tvβ enzimlerinin optimum pH değerleri 6,0; optimum sıcaklık değerleri ise sırasıyla 75°C ve 65°C olarak saptanmıştır. Thβ enzimin Km ve Vmax değerleri sırasıyla 0,25 mM ve 2500 EU; Tvβ enziminin ise 0,5 mM ve 2500 EU olarak belirlenmiştir. Ayrıca saflaştırılan β- ksilosidaz enzimlerinin aktiviteleri bir β-ksilosidaz inhibitörü olan D-(+)-ksiloza karşı belirlenmiştir. D-(+)-ksiloz inhibitörünün Thβ enzimini karışık, Tvβ enzimini ise yarışmalı olarak inhibe ettiği belirlenmiştir. D-(+)-ksilozun Thβ enzim aktivitesi üzerine IC50 ve Ki değerleri sırasıyla 1,1x10-1 mM ve 1,10x10-3/5,57x10-3; Tvβ enziminin IC50 ve Ki değerleri ise 7,1x10-2 mM ve 2,64x10-4±1x10-5 olarak hesaplanmıştır.